Claus Tollnick 1, Matthias Beuse 2
Glucose ist die mit Abstand wichtigste Nährstoffquelle für Mikroorganismen bei biotechnologischen Prozessen. In nahezu 95 % aller Kultivierungen wird diese Kohlenstoffquelle eingesetzt. Die Herstellung immer komplexerer Produkte durch zum Teil gentechnisch veränderte Organismen in hochtechnisierten Anlagen verlangt die lückenlose Überwachung der Versuchsparameter. Neben der Analyse physikalischer Parameter wie Temperatur, pH-Wert und pO2-Wert erfordern die Qualitätssicherung sowie eine gezielte Kostenrechnung die Kontrolle chemischer Größen des Produktionsprozesses, wie z.B. Glucose.
Der folgende Beitrag zeigt eine industrielle Anwendung eines Glucose-Online-Systems in der industriellen Prozeßentwicklung.
Problemstellung
Die instrumentelle Glucosebestimmung spielt heute in der Routineanalytik eine wichtige Rolle. Viele Laborgeräte sind aber bisher lediglich offline-tauglich, d.h. die Probe muß manuell bereitgestellt und die Messung per Hand gestartet werden. In der Bioprozeßtechnik ist neben einer schnellen Glucosedetektion aber auch die sterile Probenahme von großer Bedeutung. Diese Probleme in Form des Liquid-Handling" standen einer weiten Verbreitung von Glucose-Meßsystemen in der Biotechnologie im Wege. Mit dem Online-System ProcessTRACE der Trace Biotech AG läßt sich jetzt eine sichere Bestimmung von Glucose in Bioreaktoren durchführen. Ein industrieller Einsatz zur Online-Messung von Glucose erfolgt bei Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH.
Flexible Glucosemessung
ProcessTRACE dient in erster Linie der Online-Überwachung von Industrie- oder Laborkultivierungen, bei denen Glucose als Kohlenstoffquelle eingesetzt wird. Unabhängig von der Kultivierungsart (Batch, Fed-Batch, kontinuierliche Kultivierungen) ist eine kontinuierliche Glucoseanalyse mit ProcessTRACE bei nahezu sämtlichen Zell- und Mikroorganismenkultivierungen möglich. Tabelle 1 zeigt mögliche Einsatzgebiete.
Einsatzgebiete
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Glucosemonitoring in allen Bereichen der industriellen Produktion |
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Kontrolle von Kleinfermentern mit Hilfe der Dialysesonde |
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Online- und Offline-Einsatz in Forschung und Entwicklung |
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Glucosemessung in der Lebensmittelindustrie (Milch, Fruchtsaft) |
Tabelle 1: Einsatzmöglichkeiten von ProcessTRACE
Die einzelne Analyse beruht auf dem Verfahren der Fließdiffusionsanalyse (FDA), die mit einer zeitabhängigen Probeanreicherung arbeitet (Abbildung 1). Dabei werden die Meßstrecke und die Probe, bzw. die Probezuführung durch eine Membran voneinander getrennt. Die Meßstrecke wird als Akzeptor (aufnehmend) und die Probeseite als Donor (gebend) bezeichnet.
Abbildung 1: Prinzip der Fließdiffusionsanalytik
Bei einer Analyse wird der Akzeptorstrom für eine definierte Zeit hinter der Membran angehalten. Dieses geschieht durch Umschalten von Ventilen, die eine Bypass-Strecke öffnen. Die Analyten in der Probe (hier: Glucose) diffundieren währenddessen durch die Membran hindurch und reichern sich in der Akzeptorkammer an. So entsteht mit fortschreitender Dauer eine steigende Konzentration der dialysierbaren Probebestandteile im Flüssigkeitssegment des Akzeptors.
Wird dieses Segment durch die Ventile freigeschaltet, fließt es zum Detektor und erzeugt nach enzymatischer Umsetzung der Glucose ein Signal (amperometrische Messung). Die Intensität des Signals ist das Maß für die Konzentration der Probe. Die großen Vorteile dieser Meßmethode gegenüber der Fließinjektion sind einerseits der sehr breite Meßbereich, der einfach durch Variation der Anreicherungszeit erreicht wird, andererseits die hohe Standzeit des Sensors durch Trennung von Probe und Puffer.
Sterilsichere Probenahme
Bei der Analyse von Glucose in Kultivierungsmedien ist es notwendig, daß eine Probe unter sterilen Bedingungen aus dem Bioreaktor (Fermenter) entnommen wird. Dabei müssen die Reproduzierbarkeit und Relevanz der genommenen Probe gewahrt bleiben. In Verbindung mit ProcessTRACE stehen drei Probenahme-möglichkeiten zur Verfügung: Filtrationssonde, Dialysesonde und Bypassmodul. Alle Systeme erlauben eine sterilsichere Entnahme direkt aus dem Bioreaktor.
Bei der Filtrationssonde handelt es sich um die ESIP-Sonde 5441 der Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, die durch die Trace Biotech AG vertrieben wird. Die Sonde erlaubt die Entnahme von zellfreien Substratproben aus Bioreaktoren. Sie wird über einen Stutzen im Innenraum des Bioreaktors fixiert und zusammen mit dem Medium in situ sterilisiert.
Eine andere Probezuführung aus dem Bioreaktor zum Analysegerät erfolgt über eine Dialysesonde. Dabei wird die Glucose über eine Diffusionsmembran in einen Pufferstrom überführt und zur Meßzelle transportiert. Die Entnahme der Probe erfolgt volumenfrei. Die Sonde eignet sich somit besonders für Kleinfermenter im Bereich der Forschung und Prozeßentwicklung. Die prinzipielle Funktion der Sonde zeigt Abbildung 2.
Abbildung 2: Prinzipielle Funktion der Dialysesonde, einer volumenfreien Probeentnahmemöglichkeit
Die Dialysesonde ist komplett aus Edelstahl V4A (DIN 4571) nach DIN EN 1672-2 (Hygieneanforderungen) gefertigt. Sie ist damit für sämtliche Kultivierungsarten geeignet. Eine hohe Sterilsicherheit wird durch den Einsatz einer äußerst robusten Diffusionsmembran sowie temperaturstabile Dichtungsringe gewährleistet. Der Einbau in den Bioreaktor kann sowohl in den Deckel als auch in einen Seitenstutzen erfolgen.
Einsatzgebiet am Beispiel der industriellen Prozeßentwicklung
Ein typisches Anwendungsbeispiel von ProcessTRACE ist derzeit bei der Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH realisiert. Dort wird das Glucose-Online-System in der Prozeßentwicklung eingesetzt. Ziel ist eine nahezu lückenlose Überwachung der Glucosekonzentration in einem Fed-Batch-Reaktor. Über einen Bereich von 37 bis
0 g/l wird der mikrobielle Abbau der Glucose kontrolliert. Eine Fütterungsstrategie soll die Konzentration auf einen konstanten Wert regeln. Durch ProcessTRACE wird hier mit Hilfe der Probezuführung durch die Filtrationssonde ESIP die Glucosekonzentration im Abstand von drei Minuten bestimmt. Abbildung 3 zeigt den Glucoseverlauf einer Fed-Batch-Kultivierung.
Abbildung 3: Kontrolle der Glucosekonzentration während einer Fed-Batch-Kultur: Vergleich von ProcessTRACE Online-Daten mit offline ermittelten Daten (Originaldaten der HMR Deutschland GmbH)
Deutlich zu erkennen ist die Batch-Phase von der Startkonzentration mit 37 g/l bis 0 g/l. Die vor dem vollständigen Verbrauch der Glucose aktivierte Nachfütterung läßt die Konzentration wieder langsam auf 5 g/l ansteigen. Ein manuelles Nachregeln der Fütterung verursacht schwankende Konzentrationen im Reaktor.
Besonders deutlich wird der Vorteil eines Online-Glucosesystems bei Betrachtung der Offline-Daten (rot). Durch die höhere Datendichte aufgrund der Online-Messung ist eine Fehlinterpretation des Kultivierungsverlaufs ausgeschlossen. Die Offline-Daten allein reichen nicht aus, um den Prozeß in dynamischen Bereichen zu überwachen oder zu regeln.
Abbildung 4 zeigt eine Glucosefütterung mit präziser Regelung der Konzentration zwischen 0 und 0,5 g/l. Nach einer kurzen Einschwingphase ist über mehrere Stunden eine relativ konstante Glucosekonzentration zu beobachten, während die Fütterungsrate leicht ansteigt und der Gelöstsauerstoffgehalt von 42 auf 6,6 % deutlich sinkt. Ein Probenahmeabstand von drei Minuten reichte aus, um im Bioreaktor einen gleichbleibenden Glucosegehalt für die Mikroorganismen zu gewährleisten.
Abbildung 4: Glucosefütterung einer Fed-Batch-Kultivierung zwischen 0 und 0,5 g/l unter Einsatz von ProcessTRACE (Originaldaten der HMR Deutschland GmbH)
1 Hoechst Marion Roussel Deutschland GmbH,
Industriepark Hoechst, D-65926 Frankfurt
2 TRACE Biotech AG,
Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig
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